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ISSN 1001-5256
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STAT3在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用

余旺 章礼久 路燕 宋莎莎

引用本文:
Citation:

STAT3在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.04.026
基金项目: 

国家自然科学基金青年科学基金项目 81800524

利益冲突声明:本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明:余旺参与课题设计,完成实验,论文写作;章礼久、路燕负责课题设计,指导撰写文章,修改论文并最后定稿;宋莎莎负责数据分析及修改论文。
详细信息
    作者简介:

    余旺(1995—),男,主要从事肝胆胰疾病研究

    通信作者:

    章礼久,zhanglijiu6336@163.com

    路燕,luyandev@126.com

  • 中图分类号: R575

Role of STAT3 in hepatocyte regeneration after acetaminophen-induced hepatocellular injury in mice

  • 摘要:   目的  探讨STAT3在对乙酰氨基酚(APAP)致小鼠肝细胞损伤后肝细胞增殖中的作用。  方法  体外培养小鼠正常肝细胞AML12,APAP(1、2.5、5、10、20 mmol/L)刺激12、24或48 h,等体积PBS作为对照组。筛选出最佳刺激浓度和作用时间后,AG490(10、50、100 μmol/L)作用AML12。CCK8法检测AML12细胞活力。RT-PCR检测AML12中PCNA、CyclinD1、Ki67的mRNA表达水平。Western Blot法检测STAT3、p-STAT3及PCNA、CyclinD1表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  APAP作用24 h及48 h后,与对照组比较,各浓度组AML12细胞活力均降低(P值均 < 0.05);APAP浓度为2.5 mmol/L时,细胞活力分别为0.717±0.027、0.752±0.014,与对照组比较差异均有统计学意义(P值均 < 0.05),能够满足后续实验条件。与对照组比较,24 h APAP(2.5 mmol/L)组PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的表达均降低(P值均 < 0.01);与24 h APAP组比较,48 h APAP(2.5 mmol/L)组PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的表达均升高(P < 0.01),因此选择APAP 2.5 mmol/L、刺激时间48 h来模拟体外损伤AML12细胞后肝细胞再生的模型。加入AG490,与对照组比较,10、50 μmol/L AG490组细胞活力变化无统计学意义,余各组细胞活力均降低(P值均 < 0.01);与APAP组比较,AG490(50 μmol/L)+APAP组和AG490(100 μmol/L)+APAP组细胞活力降低(P值均 < 0.01),因此选择50 μmol/L AG490作为后续实验处理浓度。与对照组比较,APAP组p-STAT3的蛋白水平升高(P < 0.01),而AG490组、APAP+AG490组降低(P值均 < 0.05);与APAP组比较,APAP+AG490组PCNA、CyclinD1蛋白水平及PCNA、CyclinD1、Ki67 mRNA表达均降低(P值均 < 0.05)。  结论  STAT3参与APAP诱导小鼠肝细胞损伤后的细胞增殖,而AG490作为STAT3抑制剂通过抑制STAT3磷酸化从而抑制APAP肝损伤后肝细胞增殖。

     

  • 图  1  Western Blot法检测AML12细胞中STAT3、p-STAT3蛋白表达情况

    图  2  Western Blot法检测AG490对APAP损伤的AML12细胞PCNA、CyclinD1蛋白表达的影响

    表  1  RT-PCR引物序列

    引物名称 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′)
    18S GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG
    PCNA TGAAGAAGGTGCTGGAGGCTCTC AGCTGTACCAAGGAGACGTGAGAC
    Ki67 GCCTGCCCGACCCTACAAAATG CTCATCTGCTGCTGCTTCTCCTTC
    CyclinD1 TGACTGCCGAGAAGTTGTGC CTCATCCGCCTCTGGCATT
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    表  2  CCK8检测APAP对AML12细胞活力的影响

    组别 12 h 24 h 48 h
    对照组 0.980±0.035 1.000±0.014 0.981±0.033
    APAP 1 mmol/L组 1.010±0.042 0.931±0.0241) 0.911±0.0171)
    APAP 2.5 mmol/L组 0.971±0.029 0.717±0.0271) 0.752±0.0141)
    APAP 5.0 mmol/L组 0.925±0.040 0.672±0.0191) 0.331±0.0101)
    APAP 10.0 mmol/L组 0.918±0.063 0.596±0.0391) 0.224±0.0181)
    APAP 20.0 mmol/L组 0.982±0.019 0.601±0.0231) 0.095±0.0151)
    F 2.306 137.023 1163.999
    P 0.087 < 0.001 < 0.001
    注:与同一时间对照组比较,1)P<0.05。
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    表  3  APAP对AML12细胞增殖相关mRNA相对表达水平的定量分析结果

    组别 PCNA CyclinD1 Ki67
    对照组 1.000±0.093 1.000±0.153 1.000±0.081
    24 h APAP组 0.505±0.0261) 0.390±0.0231) 0.410±0.0441)
    48 h APAP组 1.106±0.1432) 0.829±0.0882) 2.009±0.2921)2)
    F 20.687 18.744 42.010
    P 0.002 0.003 < 0.001
    注:与对照组相比,1)P < 0.01;与24 h APAP组比较,2)P < 0.01。
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    表  4  AG490对AML12细胞及APAP损伤后的AML12细胞活力的影响

    组别 细胞活力
    对照组 0.981±0.033
    AG490 10 μmol/L组 0.959±0.019
    AG490 50 μmol/L组 0.934±0.017
    AG490 100 μmol/L组 0.772±0.0101)
    APAP 2.5 mmol/L组 0.721±0.0161)
    APAP 2.5 mmol/L+AG490 10 μmol/L组 0.694±0.0141)
    APAP 2.5 mmol/L+AG490 50 μmol/L组 0.352±0.0211)2)
    APAP 2.5 mmol/L+AG490 100 μmol/L组 0.164±0.0191)2)
    F 685.911
    P < 0.001
    注:与对照组相比,1)P < 0.01;与APAP 2.5 mmol/L组比较,2)P < 0.01。
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    表  5  Western blot检测AML12细胞中STAT3及增殖相关蛋白表达情况的定量分析结果

    组别 p-STAT3/STAT3 PCNA/GAPDH CyclinD1/GAPDH
    对照组 1.000±0.032 1.000±0.113 1.000±0.002
    APAP组 1.824±0.0561) 0.337±0.068 0.615±0.002
    AG490组 0.701±0.0041) 0.971±0.147 0.703±0.001
    APAP+AG490组 0.700±0.0331)2) 0.044±0.0032) 0.109±0.0052)
    F 211.845 22.963 16 468.823
    P < 0.001 0.006 < 0.001
    注:与对照组相比,1)P < 0.05;与APAP组比较,2)P < 0.05。
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    表  6  RT-PCR法检测AG490对APAP损伤的AML12细胞中增殖相关基因mRNA的相对表达水平

    组别 PCNA CyclinD1 Ki67
    对照组 1.000±0.050 1.000±0.138 1.000±0.081
    APAP组 1.124±0.084 0.866±0.025 1.968±0.090
    APAP+AG490组 0.534±0.0561) 0.354±0.0301) 0.253±0.0351)
    F 46.611 33.761 472.386
    P < 0.001 0.001 < 0.001
    注:与APAP组相比,1)P < 0.01。
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-09-08
  • 录用日期:  2020-10-26
  • 出版日期:  2021-04-20
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