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细胞毒性T淋巴细胞来源外泌体抑制肝星状细胞活化的机制

覃川福 赵雅丽 龙丽娟 邱华

引用本文:
Citation:

细胞毒性T淋巴细胞来源外泌体抑制肝星状细胞活化的机制

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2023.10.011
基金项目: 

国家自然科学基金项目 (81860889);

国家自然科学基金项目 (81660827);

广西自然科学基金面上项目 (2020GXNSFAA297113)

利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:覃川福负责实验研究、数据分析、论文撰写;赵雅丽负责实验研究和数据分析;龙丽娟负责实验研究及论文撰写;邱华负责课题设计,数据分析,指导实验和写作。
详细信息
    通信作者:

    邱华, qiuhua8899@163.com (ORCID: 0000-0001-7297-7214)

Mechanism of cytotoxic T lymphocyte-derived exosomes inhibiting hepatic stellate cell activation

Research funding: 

National Natural Science Foundation Project (81860889);

National Natural Science Foundation Project (81660827);

Guangxi Natural Science Foundation Project (2020GXNSFAA297113)

More Information
    Corresponding author: QIU Hua,qiuhua8899@163.com (ORCID: 0000-0001-7297-7214)
  • 摘要:   目的  探讨细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来源外泌体能否下调HBx表达从而抑制肝星状细胞(HSC)活化。  方法  收集HepG2、HepGA14、CTL细胞上清液提取外泌体(分别简写为NC-exo、HBV-exo、CTL-exo),透射电镜观察其形态,Western Blot检测外泌体标志物CD63和TSG101的表达。将氟硼二吡咯染料(BODIPY)标记的NC-exo、HBV-exo以及CTL-exo与HBV-exo按不同比例混合后,分别与HSC LX-2(HSC-LX2)共培养,荧光显微镜观察外泌体能否进入LX-2细胞,倒置显微镜观察细胞形态学改变,实时荧光定量PCR (qPCR)检测LX-2细胞中TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen1)等活化生物标志物的表达。将CTL-exo加入到HepGA14培养体系中,qPCR检测HepGA14细胞内HBV DNA、cccDNA及外泌体中HBx mRNA表达水平,Western Blot检测外泌体HBx蛋白表达水平。符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  外泌体均为双层膜结构的微囊,呈圆形或椭圆形,囊泡的直径为50~100 nm,表达标志性蛋白CD63和TSG101。荧光显微镜观察示外泌体可进入LX-2细胞,并且HBV-exo进入LX-2细胞后,HSC胞体增大、胞突伸展。qPCR结果示NC-exo、HBV-exo、NC-exo+HBV-exo和Con组LX-2细胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1基因表达水平差异均有统计学意义(F值分别为444.678、417.144、571.508,P值均<0.05)。CTL-exo干预HepGA14细胞后,qPCR结果显示HepGA14细胞中HBV DNA、cccDNA表达水平较对照组明显下降(P值均<0.05),外泌体中HBx mRNA相对表达量明显下降(P<0.05);HBx蛋白表达水平与对照组相比也明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。CTL-exo和HBV-exo按照不同比例(2∶1、5∶1、10∶1)进行混合后干预LX-2细胞,qPCR结果显示各组间LX-2细胞中TGF-β1、α-SMA和Collagen1基因表达随着CTL-exo比例的增加而逐渐减弱,差异有统计学意义(P值均<0.05)。  结论  CTL-exo可下调HBV-exo中HBx蛋白表达抑制HSC活化,提示CTL-exo有抗乙型肝炎肝纤维化作用。

     

  • 图  1  外泌体鉴定

    注: a,透射电镜观察HBV-exo形态(×60 000);b,透射电镜观察CTL-exo形态(×60 000);c:Western Blot检测NC-exo和HBV-exo标志性蛋白CD63和TSG101的表达;d,Western Blot检测CTL-exo标志性蛋白CD63和TSG101的表达。

    Figure  1.  Exosome identification

    图  2  荧光显微镜下观察外泌体进入LX-2细胞情况(×200)

    注: a,NC-exo组;b,HBV-exo组;c,Con组;蓝色荧光:HSC;绿色荧光:外泌体。

    Figure  2.  Observation of exosomes entering LX-2 cells under fluorescence microscopy(×200)

    图  3  相差显微镜下观察LX-2细胞形态学改变(×100)

    注: a,NC-exo组;b,HBV-exo组;c,Con组。

    Figure  3.  Observe the morphological changes of LX-2 cells by phase-contrast microscope(×100)

    图  4  CTL-exo对HBV感染肝细胞的影响

    Figure  4.  Effect of CTL-exo on HBV-infected hepatocytes

    表  1  qPCR引物序列

    Table  1.   Real-time PCR primer sequences

    基因 引物
    HBV DNA F:5′-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3′ R:5′-CAGCAGGATGAAGAGGAA-3′
    cccDNA F:5′-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3′ R:5′-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3′
    HBx F:5′-TCTGTGCCTTCTCATCTGC-3′ R:5′-TCGGTCGTTGACATTGCTG-3′
    TGF-β1 F:5′-GAGAAGCGGTACCTGAACCC-3′ R:5′-TGAACCCGTTGATGTCCACT-3′
    Collagen1 F:5′-CATAAAGGGTCACCGTGGCT-3′ R:5′-AGTCCATCTTTGCCAGGAGC-3′
    α-SMA F:5′-GGCAAGTGATCACCATCGGA-3′ R:5′-GTGGTTTCATGGATGCCAGC-3′
    actin F:5′-ACACCCCAGCCATGTACGT-3′ R:5′-ATGGGCACAGTGTGGGTGA-3′
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    表  2  qPCR检测不同组别中TGF-β1、α-SMA、Collagen1基因相对表达量

    Table  2.   qPCR was used to detect the relative expression of TGF-β1, α-SMA and Collagen1 genes in different groups

    组别 TGF-β1 α-SMA Collagen1
    NC-exo组 1.05 ± 0.03 1.07 ± 0.04 1.10 ± 0.03
    NC-exo+HBV-exo组 1.29 ± 0.011)2)3) 1.48 ± 0.051)2)3) 1.44 ± 0.021)2)3)
    HBV-exo组 1.74 ± 0.051)2) 2.03 ± 0.041)2) 1.81 ± 0.031)2)
    Con组 1.00 ± 0.021) 1.00 ± 0.02 1.00 ± 0.031)
    F 444.678 417.144 571.508
    P <0.05 <0.05 <0.05
    注:与NC-exo组比较,1)P<0.05;与Con组比较,2)P<0.05;与HBV-exo组比较,3)P<0.05。
    下载: 导出CSV

    表  3  不同HBV-exo、CTL-exo浓度比例干预后HSC-LX2细胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1的相对表达量

    Table  3.   Relative expressions of TGF-β1, α-SMA and Collagen1 in HSC-LX2 cells after different HBV-exo and CTL-exo concentration ratios

    组别 TGF-β1 α-SMA Collagen1
    HBV-exo组 3.18 ± 0.06 3.33 ± 0.11 2.76 ± 0.03
    CTL-exo∶HBV-exo=2∶1组 2.19 ± 0.021)2) 2.32 ± 0.061)2) 1.94 ± 0.091)2)
    CTL-exo∶HBV-exo=5∶1组 1.47 ± 0.031)2)3) 1.55 ± 0.071)2)3) 1.34 ± 0.041)2)3)
    CTL-exo∶HBV-exo=10∶1组 1.20 ± 0.021)2)3)4) 1.17 ± 0.041)3)4) 1.07 ± 0.021)3)4)
    Con组 1.00 ± 0.021) 1.00 ± 0.001) 1.00 ± 0.031)
    F 2 166.655 641.874 712.279
    P <0.05 <0.05 <0.05
    注:与HBV-exo组比较,1)P<0.05;与Con组比较,2)P<0.05;与CTL-exo∶HBV-exo=2∶1组比较,3)P<0.05;与CTL-exo∶HBV-exo=5∶1组比较,4)P<0.05。
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  • 收稿日期:  2022-12-21
  • 出版日期:  2023-10-30
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