许瑞云 中山大学附属第三医院
门静脉高压症的治疗研究在临床上已进行多年，但好像总也离不开断流术、分流术、断流与分流联合术等手术治疗的框架，疗效徘徊不前，让人感觉举步维艰。因此，近年来不少人提出疑问：门静脉高压症的研究是不是到了尽头？肝移植的迅猛发展似乎让人看到了希望。的确，肝移植不仅解决了门静脉高压症的问题，同时也解决了疾病的根本，即肝硬化的问题，可谓既治标又治本，一箭双雕。因此，最近又有另一种观点在学术界流行：肝硬化与门静脉高压症的根本出路在于肝移植。
但情况果真如此吗？据调查，我国城乡人均年收入为8000元，而每例肝移植的平均费用为30万元。这意味着患者必须不吃不喝积攒40年才支付得起手术费用，这还不包括术后长期免疫抑制治疗的费用。如果按目前广大农民的收入计算，能负担肝移植的人恐怕更是寥寥无几。不仅如此，肝移植还存在其他一些缺点：①供体十分紧缺；②免疫排斥问题没有解决，长期服用免疫抑制剂带来其他问题；③生存期尚远不如人意。由此可见，肝移植绝不是肝硬化和门静脉高压症的惟一选择，寻找其他更为理想的治疗方法意义十分重大。
最近，有关干细胞的研究进展让人重新看到了曙光，引起了生命科学家的极大关注。欧美许多著名科学家预言，在不久的将来，骨髓干细胞移植可能替代肝移植成为治疗慢性终末期肝病的主要手段。
干细胞的分类、命名与特性
干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，在合适的条件（或诱因）下，可以分化为多种不同类型的、具有特征形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。干细胞可按分化潜能分为全能干细胞、多能干细胞（包括胚胎多能干细胞与成体多能干细胞）和单能干细胞；或是按发育进程将干细胞分为胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞和成体干细胞。
其中，成体干细胞源于骨髓、血液、脑和脊髓、骨骼肌和心肌、肝脏、胃肠道上皮、胰腺等，存在于全部3个胚层发育而来的组织器官中，也属于多能干细胞。成体干细胞中研究最为广泛和深入的是源于血液和骨髓的干细胞，包括造血干细胞和骨髓间（充）质干细胞。骨髓间质干细胞能否分化为肝实质细胞？这是本文要重点阐述的内容。
骨髓干细胞的研究进展
骨髓内存在大量的成体干细胞，包括造血干细胞、骨髓间质干细胞、骨髓源性基质细胞等，甚至有人认为存在残余的胚胎干细胞，故有人将其称为“自体损伤细胞修复库”。
1999年，Peterson在《Science》撰文，他将雄性大鼠的骨髓移植到受致死量放射线照射的同系雌性大鼠体内，用DNA探针检测Y染色体的sry 区，以鉴别受体肝脏中供体来源的细胞。所有受体大鼠均预先以四氯化碳（CCl4）造成肝损伤，并预先给予2-乙酰氟胺（2-AAF）抑制肝细胞的自我增生。结果分别于移植后第9 天和第13天发现雌性大鼠的肝间质细胞和肝细胞中出现含Y染色体的细胞。从而证实骨髓干细胞确实能分化为肝实质细胞。
2000年，Theise在《Hepatology》报道，这种现象同样也存在于人类。他对2例女性骨髓移植患者（骨髓供体为男性）和4例男性原位肝移植患者（肝脏供体为女性）的尸检和活检肝脏标本为研究对象，结果表明人类的肝脏细胞一部分是由循环中的干细胞（最可能是源于骨髓的干细胞） 转化而来。
2000年，Lagasse在《Nature Medicine》报道了利用骨髓干细胞进行移植治疗的实验研究。他采集正常成年小鼠骨髓细胞中纯化的干细胞，经外周静脉移植治疗Ⅰ型酪氨酸蛋白血症模型小鼠，观察模型小鼠的生长状况及其肝脏生化功能的恢复情况。结果发现，骨髓中的干细胞不仅能在体内转化为肝细胞，而且使受体小鼠肝脏的生化功能得以恢复。
上述一系列研究成果不断在国际上引起轰动。此后，有关骨髓干细胞的研究热潮一浪高过一浪，越来越多的类似报道在国际著名期刊上相继发表，所有这些研究均为临床应用奠定了极好的基础，初步展现了肝硬化治疗的曙光。
骨髓干细胞移植治疗肝硬化存在的问题
肝硬化是我国门静脉高压症的主要病因。肝硬化的前期病理变化是肝纤维化，这是一个持续、缓慢、渐进性的病理过程，其后果是肝实质细胞逐渐减少和纤维组织逐渐增多，终致肝脏不能发挥正常功能。阻断与逆转肝纤维化的进展或促进肝实质细胞的生长，是治疗肝硬化的关键。已证实，移植的肝细胞在体内长期存活和增殖非常困难，故而肝细胞移植的临床实用价值不大。骨髓干细胞移植从理论上不仅具有优良的疗效，而且具有其他疗法无可比拟的优点。然而，骨髓干细胞的研究还处在实验阶段，实际应用还存在不少问题，要过渡到临床实用还有许多难题等待我们去解决。
骨髓干细胞向肝实质细胞的转化是否是完全意义上的转化？
到目前为止，所有有关骨髓干细胞向肝细胞转化的研究大多来自于实验，而且判断转化的观测指标仅限于细胞形态和小部分细胞功能（或少数细胞标志物）。转化后的肝细胞能否完全行使正常肝细胞的功能，并替代受损或病变的肝细胞？即：这种转化是否是完全意义上的转化？目前尚无定论。
如何改善骨髓干细胞向肝实质细胞的转化过程？
研究表明，经外周静脉输注骨髓干细胞后，通过细胞自然分化、增殖以替代受损肝细胞的过程，是一个非常缓慢而少量的过程。如果仅依靠骨髓干细胞的这种自然转化难以实现临床治疗目标。导致这种情况的原因目前还不清楚，可能与肺吞噬细胞的清除作用有关。那么，如何才能诱导、促进或加速骨髓干细胞向肝细胞转化？直接将骨髓干细胞移植到肝内是否有助于解决这一难题？或者，使用一些促进细胞生长的因子（如肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等）是否能加速这一过程？
持续性肝损害是骨髓干细胞向肝细胞转化的启动因素，肝炎肝硬化时是否存在类似情况？
研究表明，肝功能持续损害是骨髓干细胞向肝细胞转化的启动因素，骨髓干细胞向肝细胞的转化量随肝损伤程度和时间的增加而增加：肝损害越重、持续时间越长，越有利于骨髓干细胞向肝细胞分化。然而，所有这些研究结论都是源于CCl4和DMN诱导的动物肝损害或肝硬化模型，与人类的肝炎肝硬化有一定区别。肝炎肝硬化患者施行骨髓干细胞移植后，能否实现向肝细胞的转化还不清楚，尤其是肝炎病毒对移植效果的影响还不明确，亟待进一步研究。
肝损害时体内是否产生了诱使骨髓干细胞向肝细胞转化的因子？
持续性肝损害为什么能启动骨髓干细胞向肝细胞转化？这是否意味着肝功能持续损害时，体内产生了某种促使骨髓干细胞向肝细胞转化的诱导因子？能否分离、鉴定或合成这些因子？以色列科学家在对大量研究结果进行分析后大胆提出假设，当肝脏遇到损害时，它会向骨髓发出求救信号（信号因子），骨髓干细胞在接到信号后，会及时“赶来”帮助修复受损的肝细胞。这听起来似乎很玄妙，但确实耐人寻味。
我们的一些工作
为了加强骨髓干细胞的临床研究工作，中山大学干细胞研究所于2003年正式成立，并在2004年初，与中山大学肝脏病医院合作启动了骨髓干细胞移植治疗慢性肝病的基础与临床研究。
MSC抗肝纤维化作用的实验和临床研究
我们将MSC（MSC组）和生理盐水（对照组）分别经尾静脉注入到肝纤维化模型大鼠体内，然后分离肝脏的星状细胞（HSC），对HSC的平滑肌肌动蛋白α（SMA-α）、促凝血素A2受体（TxA2r）及胶原合成进行分析。结果提示，MSC组大鼠HSC的 SMA-α、TxA2r和胶原合成明显下降；流式细胞仪分析显示，大量的HSC由S期进入G0/G1期。证实了MSC在模型大鼠体内的抗肝纤维化作用。此外，我们还进行了MSC治疗肝硬化的临床研究，表明MSC具有治疗肝硬化和肝功能不全的作用。
乙肝患者与健康人之间MSC生物学行为存在差异
为了研究自体骨髓干细胞移植与异体移植的差异，我们对慢乙肝患者的MSC与健康人MSC之间的生物学特性进行了比较。我们发现，慢乙肝患者MSC的体外凋亡活性明显高于健康人，而增殖能力以及所表达的细胞因子水平则明显低于健康人。从而为异体骨髓干细胞移植的合理性提供了依据。
开展了MSC体外构建肝脏组织工程的研究
目前对MSC向肝细胞的诱导分化研究大部分是在平面上进行，鲜有在立体结构上诱导分化的研究报道。我们将大鼠MSC接种于海藻酸三维立体支架上，采用倒置相差显微镜、扫描电镜、石蜡包块切片等检测二者的相容性，并给予诱导液诱导MSC向肝细胞分化，检测培养液内尿素氮和白蛋白（ALB）含量的变化，并用RT-PCR检测细胞ALB和AFP基因的表达。发现大鼠MSC在海藻酸三维立体支架内能良好地黏附、生长和增殖，加入诱导液诱导后，培养液中的尿素和ALB的含量逐渐上升，检测到AFP和ALB的基因表达。海藻酸三维立体培养支架与大鼠BMSC具有良好的相容性；通过诱导，MSC在海藻酸支架上能够向肝细胞方向分化，二者有望成为肝脏组织工程新的种子细胞和细胞载体。
MSC与HSC之间存在Hedgehog(Hh)信号转导通路
为研究MSC抗肝纤维化的机理，我们还成功建立了MSC/HSC的体外共培养体系，在国际上首次发现并报道了在MSC与HSC之间存在的Hedgehog(Hh)信号转导通路；并证明活化态HSC可通过Hh信号通路，促进MSC增殖并向肝样细胞分化；而活化态HSC本身的增殖则受到可能来自于MSC的抑制，细胞周期分析显示大量的HSC由S期进入G0/G1期。
MSC诱导HSC凋亡的旁分泌机制
我们对人MSC/HSC共培养体系的进一步检测发现MSC能分泌促凋亡因子HGF、NGF、FasL、 IL-10，而HSC凋亡相关蛋白Caspase-3，Caspase-8以及Bcl-2家族成员Bcl-2，Bcl-XL，BAX和NF-κB的基因表达则出现显著变化；MSC分泌的NGF可与HSC表达的NGF受体P75相结合，诱导活化态HSC发生凋亡。
总之，骨髓干细胞移植治疗肝硬化的研究还处于起步阶段，仍有许多难题和问题有待解决。但我们相信，干细胞时代已经到来，骨髓干细胞移植治疗慢性肝病与肝硬化的临床应用决不会太遥远。
