HBsAg 是HBV 感染患者体内最先出现的HBV 相关蛋白，血清HBsAg 定性检测阳性是HBV 现症感染的标志。最近，血清HBsAg 定量检测的临床意义引起学界广泛的关注，原因是HBsAg 水平可反映肝内共价闭合环状DNA（cccDNA ）的水平。在聚乙二醇干扰素（peg-IFN ）治疗过程中，HBsAg 水平对慢性乙型肝炎（CHB ）患者的持续病毒学应答有较好的预测价值。然而，在慢性HBV 感染的自然病程中，病毒、肝细胞和宿主免疫系统之间存在长期持续的相互作用，病毒复制与HBsAg 的合成是一个动态变化的过程。
目前在临床实践中如何判读血清HBsAg 水平尚存在很大争议，未经药物干预的HBV 感染自然史中HBsAg 的基线水平及变化尚鲜见有效评估。因此，本研究观察了99 例未经抗病毒治疗的慢性HBV 感染者，在感染不同阶段血清HBsAg 水平的变化及其与HBV DNA 和其他临床指标的关系，为正确分析慢性HBV 感染自然史中HBsAg水平的变化及意义提供参考。
对象与方法
一、病例选择
2010 年5 月至2011 年4 月在青岛大学医学院附属医院感染科就诊的CHB 患者99 例，诊断标准依据2000 年第10 次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案：既往有乙型肝炎病史或HBsAg 阳性超过6个月，现HBsAg 和（或）HBV DNA 仍为阳性。所有患者均未接受抗病毒治疗及免疫调节剂治疗。排除标准：①合并HAV 、HCV 、HDV 、HEV 感染及HIV 感染；②药物或酒精性肝损害及高乙醇摄人（＞40 g/d ）；③合并肝硬化、肝癌或其他恶性肿瘤；④合并自身免疫性肝炎和肝代谢性疾病；⑤既往应用抗病毒药物、免疫调节剂或免疫抑制剂治疗；⑥严重心、肺、肾及血液系统疾病。
二、分组标准
根据HBV 感染自然史将入选病例分为4 组，标准参照2005 年版慢性乙型肝炎防治指南，见表1 。
表 1 99 例慢性HBV 持续感染者的分期
注： HBV 为乙型肝炎病毒；HBeAg 为乙型肝炎病毒e 抗原；ALT 为丙氨酸转氨酶；ULN 为正常值上限
三、观察指标及实验方法
1.HBsAg 定量检测：应用Architect i2000SR 设备，采用化学发光微粒子免疫分析（CMIA ）技术，双抗体夹心两步法对待测样品中的HBsAg 进行定量检测。操作按照试剂盒说明书和仪器操作手册进行。检测范围为0.05～250 IU/mL ，当HBsAg ＞250 IU/mL 时，则需使用ArchitectHBsAg 手工稀释液对样本进行1 ：500 或1：1000 稀释后，再重复检测。
2.HBV DNA 检测：应用荧光定量PCR 技术检测HBV DNA 载量，仪器为PE Gene Amp7300 荧光PCR 检测仪，试剂由深圳匹基生物工程有限公司生产，最低检测限为1000 拷贝/mL 。
3. 生物化学指标及血常规检测：使用OPUS 全自动生物化学分析仪测定Alb 、TBil 、ALT 、AST 、γ-GT 等生物化学指标；使用Sysmex XE-2100 全自动血常规分析仪测定Hb 、WBC 、PLT 。病毒学和生物化学检测均取自同日采集的血清样本。
四、统计学方法
采用SPSS 13.0 软件对数据进行分析。由于HBV DNA 和HBsAg 定量值为非正态分布，故经对数转换后使其符合正态分布后再行统计学分析。计量资料以x±s 或中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较分别采用￡检验、X2 检验和单因素方差分析，相关分析采用Spearman 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。
结 果
一、一般资料
共有99 例符合条件的未经抗病毒治疗的CHB 患者入选，男53 例，女46 例，年龄13 ～65 岁，平均（35.7±11.0 ）岁。HBeAg 阳性患者（免疫耐受期和免疫清除期）平均年龄为（28.3±9.5 ）岁，明显低于HBeAg 阴性患者（低病毒复制期和再活动期）的（42.1±7.9 ）岁（t=62.163 ，P ＜0.05 ）。各组间TBil、ALT 、AST 、γ-GT 水平的差异有统计学意义，性别、Hb 、WBC 、PLT 、Alb 的差异均无统计学意义，见表2 。
表 2 慢性乙型肝炎患者不同阶段的一般资料和主要临床检测指标
注：Hb 为血红蛋白；WBC 为白细胞；PLT 为血小板；Alb 为白蛋白；TBil 为总胆红素；ALT 为丙氨酸转氨酶；AST 为天冬氨酸转氨酶；γ-GT 为γ- 谷氨酰转肽酶
二、各阶段血清HBsAg 水平的变化HBV 慢性感染的各阶段血清HBsAg 水平不同，差异有统计学意义（X2= 46.783 ，P ＜0.05 ）。各阶段HBsAg 水平[ 中位数（下四分位数，上四分位数）] 分别为：免疫耐受期34 279（24 352 ，196 848 ）IU/mL ，免疫清除期14 313 （4316 ，43 674 ）IU/mL ，低复制期759 （162 ，2405）IU/mL ，再活动期2791 （764 ，5832 ）IU/mL 。HBsAg 水平在免疫耐受期最高，免疫清除期次之，再次为再活动期，其HBsAg 水平约为免疫清除期的1/5 ，而低复制期HBsAg 水平最低，约为免疫清除期的1/20 。
三、各阶段血清HBsAg 水平与HBV DNA 的关系
各组血清HBsAg 水平与HBV DNA 载量经对数转换后的结果见表3 ，HBsAg/HBV DNA 在低复制期最高，与免疫耐受期、免疫清除期、再活动期相比，差异有统计学意义。总体上CHB 患者的血清HBsAg 水平与HBV DNA 载量呈正相关（r=0.713 ，P ＜0.05 ），见图1 。在HBV 慢性感染的4 个时期中，免疫清除期血清HBsAg 水平与HBV DNA 载量呈正相关（r=0.747 ，P ＜0.05 ），免疫耐受期（r=0.310 ，P=0.18 ）、低复制期（r=0.247，P=0.23 ）、再活动期（r-0.296 ，P=0.13 ）HBsAg 水平与HBV DNA 载量呈正相关趋势，但无统计学意义。
四、血清HBsAg 水平与其他临床指标的关系
CHB 患者的血清HBsAg 水平与患者年龄呈负相关（r=0.592 ，P ＜0.05 ），与TBil （r=0.015 ）、ALT（r=-0.017 ）、AST （r=-0.043 ）、γ-GT （r=0.074 ）均未表现出明显的相关性（均P ＞0.05 ）。HBV 感染不同阶段HBsAg 水平与其他临床指标的相关性见表4 。
表 3 HBV 慢性感染不同阶段HBsAg 水平、HBV DNA 载量及HBsAg/HBV DNA （x±s ）
注：HBV 为乙型肝炎病毒；HBsAg 为乙型肝炎病毒表面抗原
注：HBV 为乙型肝炎病毒；HBsAg 为乙型肝炎病毒表面抗原
图 1 慢性HBV 感染患者血清HBsAg 与HBV DNA 的相关性
表 4 HBV 感染不同阶段HBsAg 水平与其他临床指标的相关性
注：HBV 为乙型肝炎病毒；HBsAg 为乙型肝炎病毒表面抗原；TBil 为总胆红素；ALT 为丙氨酸转氨酶；AST为天冬氨酸转氨酶；γ-GT 为γ- 谷氨酰转肽酶
讨 论
持续HBV 感染是一个复杂的动态变化的过程，依据病毒自身的变化和宿主免疫应答状态，可将慢性HBV 感染过程分为4 个期：免疫耐受期、免疫清除期、低复制期、再活动期。目前有关HBsAg 的研究多集中在HBsAg与cccDNA 的关系及通过HBsAg 定量检测来预测抗病毒治疗的应答效果等方面，而HBV 感染自然史中HBsAg 水平自身的变化并未受到充分重视。
本研究显示，在慢性HBV 感染的不同阶段HBsAg 水平存在差异，表现为免疫耐受期最高，免疫清除期次之，低复制期最低，再活动期再度升高，介于低复制期与免疫清除期之间。这种HBV 感染自然史中HBsAg 水平的变化可能与宿主免疫状态有关。既往研究表明，HBsAg 含量的减少依赖于肝内实际病毒模板数量的减少。在CHB 的发展过程中，机体免疫系统经历了从不识别病毒、试图清除病毒、到控制病毒（或未能控制病毒）的转变。随着对HBV 特异性免疫的建立，机体对HBV 免疫清除不断提高，表现为HBsAg 水平在免疫耐受期、免疫清除期和低复制期逐渐下降，而再活动期又再度升高。这个结果与Jaroszewicz 等的研究结论一致。Rodella 等发现，急性乙型肝炎患者急性期与恢复期血清HBsAg 水平呈迅速下降趋势。因此，HBsAg 水平是可以反映机体免疫状态的血清学指标，与机体免疫系统对病毒的控制程度密切相关。
目前HBsAg 与HBV DNA 是否存在直接关联在学界尚存争议。理论上，HBsAg 的转译模板（前S1 、前S2/S 基因）和HBV DNA 的复制模板（前基因组mRNA ）均源自于cccDNA ，因此两者之间应该存在某种联系。有研究发现，抗病毒治疗过程中HBsAg 与HBV DNA 存在良好的相关性。但也有学者认为，血清HBsAg 水平与HBV DNA 水平之间缺乏相关性或存在负相关性。本研究观察了慢性HBV 感染人群HBsAg 水平与病毒复制的关系，结果表明，总体上血清HBsAg 水平与HBV DNA 载量呈正相关，在HBV 慢性感染的4 个时期中，尤以免疫清除期二者相关性最为显著，说明随着宿主对病毒的免疫清除增强，完整病毒颗粒数量减少，因而HBsAg 水平与HBV DNA 载量同步下降。Jaroszewicz 等对12 例急性乙型肝炎患者随访28 、d 发现，HBsAg 水平与HBV DNA 存在非常明显的相关、性。提示在感染的早期阶段，有效控制病毒复制的宿主免疫系统对病毒复制和HBsAg 合成过程的作用强度可能更趋于一致。而在免疫耐受期、低复制期和再活动期，HBsAg 水平与HBV DNA 载量仅呈现一定程度的正相关趋势，但无统计学意义，提示在慢性HBV 持续感染过程中，HBsAg 的合成与HBV 复制并不完全“同步”。临床医师在判读HBsAg 效价评估病毒复制状态时，应考虑到不同感染时期的影响，不能一概而论。
本研究进一步比较了CHB 各时期的HBsAg （lgIU/mL ）/HBV DNA （lg 拷贝/mL ），该比值可反映HBsAg 合成与HBV 复制的相对关系。结果表明，低复制期HBsAg/HBV DNA 明显高于免疫耐受期、免疫清除期和再活动期。结合该时期HBsAg 水平最低，且HBsAg 水平与HBVDNA 载量相关性最不明显，提示低复制期宿主对HBV复制的免疫控制并不必然导致HBsAg 合成的抑制，HBsAg 与HBV DNA 的合成存在明显不同步：一方面，机体对HBV 复制产生有效的免疫控制，血清完整病毒颗粒减少，HBsAg 水平及HBV DNA 载量均降低；另一方面，HBsAg 相对HBV DNA 仍保持较高水平的产生。原因可能包括以下3 方面。①宿主免疫对病毒复制和HBsAg 合成通路的作用机制不同，HBV 复制周期需要前基因组RNA （pgRNA ）包入病毒核心颗粒中实现“农壳化”。有证据表明，HBeAg 阴性阶段在宿主强大的免疫压力下，胞内抑制性细胞因子（如TNF-α ）优先抑制“衣壳化”过程，使病毒复制减少，而HBsAg 合成通路未受影响。②不同感染阶段病毒复制的调节机制不同，完整病毒颗粒与亚病毒颗粒的比例发生变化。早期研究显示，与复制活跃期相比，低复制期缺陷的HBsAg 颗粒（亚病毒颗粒）所占的比例更高，尚不清楚这是否为病毒的代偿机制。提示在研究HBsAg 与HBV DNA 的关系时，应考虑到在慢性HBV 感染过程中合成占优势的HBsAg 组分与病毒复制的关系。③HBV 在复制过程中发生了病毒基因组与宿主基因的整合。整合的序列不是完整的基因，故不能成为复制模板合成完整病毒。然而病毒外膜基因（S 基因）增强子I （Enhl ）序列常较完整地存在于整合的HBV 区段中，所以整合型病毒基因片段仍能产生大量HBsAg 。整合可发生在HBV 感染的早期，并随着慢性感染时间的持续而增加，不断发生的整合可为HBsAg 合成提供独立于病毒复制的持久模板，这可能加剧了病毒感染后期HBsAg 与HBV DNA 的分离。
此外，本研究显示，HBsAg 水平与患者年龄呈负相关，年长的患者血清HBsAg 水平低于年幼的患者，说明随着年龄的增长，HBsAg 的合成逐渐减少，与之前研究一致。原因可能包括以下两方面。①通常情况下患者年龄越高，在慢性HBV 感染的自然史中对应的分期越晚。随着感染的持续，患者免疫系统对病毒复制的控制逐渐增强，因此HBsAg 的合成下降。②前S 区缺失突变株更常见于老年患者。多种前S 区缺失突变株的出现会导致HBsAg S 蛋白的合成和分泌明显下降。
目前关于HBsAg 水平与反映肝脏功能的生物化学指标关系的研究较少。有学者发现，HBeAg 阳性患者血清ALT水平与肝组织内HBsAg 阳性肝细胞数量及强度呈负相关，推测高血清ALT 水平意味着机体产生更活跃的抗病毒免疫，后者抑制了肝细胞内HBV 复制和病毒衣壳的装配。本研究在血清中未观察到HBsAg 水平与反映肝脏炎症活动度的TBil 、ALT 、AST 等指标表现出明显的负相关，可能是由于慢性HBV 感染患者血清中亚病毒颗粒水平远远超过完整病毒颗粒水平，干扰了外周循环中HBsAg 水平与肝功能指标的联系。
近十年来，随着HBsAg 定量检测手段不断更新发展，HBsAg 定量检测常规用于临床成为可能。HBsAg 定量在慢性HBV 感染不同阶段的表现提示，HBsAg 水平可作为血清HBV DNA 和HBeAg 的有效补充，为判定CHB 患者的临床分期、评估宿主免疫状态、预测抗病毒治疗的应答效果等提供更全面的信息，从而帮助临床医师做出决策，对抗病毒治疗方案进行优化。
