肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC)人群是一个异质性较大的群体，不同个体的瘤体大小、分化程度及伴随的肝脏疾病各不相同[1]。由乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）或者酒精性肝炎引起的肝癌常伴有肝硬化的发生[2,3]。肝硬化是引起肝癌发生的重要病理改变之一，但亦有7%-54%（具体比例取决于地理区域和肝癌病因）的肝癌是在非肝硬化的基础上发生的[4-6]。起源于肝硬化组织的肝癌（HCC with cirrhosis，HCC-C）和起源于非肝硬化组织的肝癌（HCC without cirrhosis，HCC-NC）在组织学和生物化学特征上有着明显的差异。HCC-C患者通常所患肿瘤结节为多个，瘤体较小[7-9]，并常伴有P53、Rb、IGF2R、p16INK4等抑癌基因的突变或缺失和癌基因及相关信号通路的激活如β-catenin、Ras-MAPK等。而HCC-NC患者则较少出现P53基因突变，却常伴有β-catenin突变、p14失活和DNA错配修复[8,10]。
无论是原发性肝癌还是复发性肝癌，早期发现并及时给予干预无疑可以延长患者的生存时间。因而发现可以影响肝癌预后的肿瘤相关因素和生物标记物具有重要意义，可对容易复发的患者进行密切监测，以便及早发现并处理复发病灶[11]。在众多肝癌临床参数中肿瘤个数、有无血管侵犯和肿瘤大小常被认为和肝癌患者的预后密切相关[12,13]，而其他参数如性别、年龄、分化程度、术前血清AFP水平等则和肝癌患者预后的关系则存在争议[12-14]。目前绝大部分研究均将HCC-C和HCC-NC视为一个整体进行分析，进行亚组分析的研究较少。
因HBV和肝癌的发生发展关系密切，理论上术后抗病毒治疗应该能够改善HBV相关肝癌患者的预后，但目前临床上尚未就此形成一致意见。部分研究者发现术后抗病毒治疗能获得令人满意的效果[12,15]，但另一部分研究者却未得到理想结果[16,17]。
目前已有不少生物标记物被报道能用于肝癌预后的判断，但如此同时也有不少与之相反的报道[18-20]。如缺氧诱导因子-1α（(HIF-1α)和肝癌患者预后的关系仍不清楚，有文献报道其同肝癌患者预后成负相关，但亦有文献显示其和肝癌患者预后无关[18-20]。为了探究目前肝癌预后分析中存在诸多争议的原因，我们对某医疗中心在过去的19年里收治的339例接受了根治性切除术的肝癌患者进行了回顾性分析。分析了肝癌常见临床参数和三个生物标记物（HIF-1α、乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）、HBx双突变）同肝癌患者预后的关系。我们的预定假设为肝癌常见临床参数及三个生物标记物在肝硬化起源的肝癌组织和非肝硬化起源的肝癌组织中的预测价值不同。
因HBV和肝癌的发生发展关系密切，理论上术后抗病毒治疗应该能够改善HBV相关肝癌患者的预后，但目前临床上尚未就此形成一致意见。部分研究者发现术后抗病毒治疗能获得令人满意的效果[12,15]，但另一部分研究者却未得到理想结果[16,17]。
目前已有不少生物标记物被报道能用于肝癌预后的判断，但如此同时也有不少与之相反的报道[18-20]。如缺氧诱导因子-1α（(HIF-1α)和肝癌患者预后的关系仍不清楚，有文献报道其同肝癌患者预后成负相关，但亦有文献显示其和肝癌患者预后无关[18-20]。为了探究目前肝癌预后分析中存在诸多争议的原因，我们对某医疗中心在过去的19年里收治的339例接受了根治性切除术的肝癌患者进行了回顾性分析。分析了肝癌常见临床参数和三个生物标记物（HIF-1α、乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）、HBx双突变）同肝癌患者预后的关系。我们的预定假设为肝癌常见临床参数及三个生物标记物在肝硬化起源的肝癌组织和非肝硬化起源的肝癌组织中的预测价值不同。
1 资料和方法
1.1 患者和临床信息
本研究统计分析了香港中文大学威尔斯亲王医院1995年-2013年收治的580肝癌病例。本研究以肿瘤标志物预后研究报告规范（REMARK）为指导（补充表1）[21]。患者入选标准为：1）首次诊断为肝癌，术前未接受过任何抗肿瘤治疗；2）肝功能检测示：Child-Pugh A级；3）无远处转移；4）患者接受肝癌根治术；5）不合并有其他类型的恶性肿瘤，无自身免疫性疾病，无严重心、肺、肾及血液系统疾病；6）血清乙肝表面抗原阳性和丙肝核心抗体阴性；7）不伴有门静脉高压症；8）随访信息完备。本研究方案经过医院伦理委员会审核批准，所有患者自愿签署知情同意书。根治性切术定义为：肿瘤完整切除，显微镜下标本切缘无肿瘤细胞残留。血清白蛋白、谷丙转氨酶（ALT）、胆红素、甲胎蛋白（AFP）均从病例资料中获取。手术后所有的肝脏标本由病理学专家在单盲状态下进行病理检测。
1.2 患者随访
术后第一年，每3个月随访一次。术后第二年，每4个月随访一次。以后每半年随访一次。肿瘤复发通过CT、MRI等加以诊断。患者死亡信息通过社会保障死亡记录、医疗记录或患者家人处获取。研究终点定义为患者死亡或肿瘤复发。总生存期（overall survival，OS)定义为由术后到死亡或者2014年6月26日的间隔时间。无病生存期（disease free survival，DFS）定义为术后到首次复发的间隔时间。本组患者随访时间为11-215个月，中位随访时间为100个月。
1.3 免疫组织化学法分析
免疫组织化学法操作同之前的报道[22,23]。HBx的评分标准参考已发表的文献，切片中阳性细胞<10%为“-”，10%-50%为“+”，>50%为“++”。将“-”定义为阴性表达，除此外定义为阳性表达[24]。
1.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）
酶联免疫吸附实验的操作同之前的报道[22]。
1.5 DNA扩增和测序
HBx的核酸序列扩增和测序的操作同之前的报道[22]。
1.6 统计处理
连续性数据用中位数和全距进行描述，离散型变量用绝对值和相对频率进行描述。分析HCC-C或者HCC-NC患者基本临床特征时分类变量采用卡方检验或Fisher精确概率法；连续性变量的分析采用非参数Kruskal–Wallis方差分析。线性关系评估时计算Spearman或Pearson相关系数。生存率计算及生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，单因素预后分析采用Log-rank检验，多因素预后分析采用Cox比例风险模型。纳入风险评估的临床参数有年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数量、有无肝硬化、术前血清白蛋白、谷丙转氨酶、胆红素、AFP、肿瘤分化程度、肉眼血管侵犯。根据之前的经验血清白蛋白、谷丙转氨酶、胆红素、白蛋白所取的cut-of值分别为80 IU/L，35 g/L，20 µmol/L和400 ng/ml[25,26]。抗病毒治疗方案同之前的文章报道[27]。Cox回归分析采用向后消除法。上述统计分析由SPSS 16.0和STATA 12.0软件完成。P<0.05为差异有统计学意义。对于缺失的数据的处理采用多重填补法由STATA 12.0软件完成。
2 结果
2.1 患者临床特征
580例肝癌患者中60例因术前接受了抗肿瘤治疗被排除；72例因乙肝表面抗原阴性或者丙肝核心抗体阳性被排除；109例因乙肝表面抗原或者丙肝核心抗体或随访资料缺失被排除；7例肝癌患者因肝功能Child-Pugh B级被排除。最终339例肝癌患者入选。患者入选及排除流程图如图1所示。339例肝癌患者中，9例缺少术前AFP的记录，15例缺少血清白蛋白、谷丙转氨酶、胆红素的记录。所有入选患者均术后病理确诊为肝细胞癌，其中203例（59.9%）伴有肝硬化，136例（40.1%）未合并肝硬化。入选患者的临床资料如表1所示。与HCC-NC患者相比HCC-C患者的肝癌结节数量较多（P=0.05），但HCC-C患者所患的肝癌直径常较HCC-NC患者的小（4.32±0.38 vs. 5.67±0.30 cm，P<0.01）。两亚组在术前肝功能上没有明显差异，表明HCC-C患者术前肝功能处于完全代偿状态。
2.2 肝硬化是肝癌患者远期预后不良的危险因素
HCC-NC患者平均OS为121.7±8.5个月，而HCC-C患者平均OS为86.3 ± 7.6个月，见补充图1（P=0.001）。HCC-NC患者1，3，5，10年的生存率分别为85.0%，66.6%，63.0%和45.5%。HCC-C患者1，3，5，10年的生存率分别为81.4%，50.7%，37.8%和26.8% (P<0.05，表1)。HCC-C患者1，3，5年的复发率分别为9.3%，31.1%和43.2%，而HCC-NC患者1，3，5年的复发率分别为9.3%，25.0%和28.6%(表1)。HCC-C患者平均DFS为65.2±7.1个月，而HCC-NC患者平均OS为87.9±7.3个月(补充图 1B)。这些数据提示肝硬化是肝癌患者根治术后远期预后不良的危险因素。但肝硬化和肝癌患者近期预后无关，因为HCC-C和HCC-NC患者1年存活率和1年、3年复发率无明显差异(表1)。
通过Cox单因素和多因素回归分析筛选出5个和肝癌生存及复发密切相关的危险因素，分别为多个肿瘤结节，宏观血管侵犯，AFP > 400 ng/ml，肝硬化和肿瘤最大直径> 5 cm（补充表2）。抗乙肝病毒治疗是肝癌患者术后预后良好的保护因素（补充表2）。肝癌合并肝硬化患者呈现出较差的OS（风险比=1.898，95%可信区间：1.285-2.803，P=0.001）和DFS（风险比=1.549，95%可信区间：1.090-2.203，P=0.015）（补充表2）。
通过Cox单因素和多因素回归分析筛选出5个和肝癌生存及复发密切相关的危险因素，分别为多个肿瘤结节，宏观血管侵犯，AFP > 400 ng/ml，肝硬化和肿瘤最大直径> 5 cm（补充表2）。抗乙肝病毒治疗是肝癌患者术后预后良好的保护因素（补充表2）。肝癌合并肝硬化患者呈现出较差的OS（风险比=1.898，95%可信区间：1.285-2.803，P=0.001）和DFS（风险比=1.549，95%可信区间：1.090-2.203，P=0.015）（补充表2）。
2.3 HCC-C和HCC-NC患者预后的影响因素
将肝癌患者按是否合并肝硬化分为两个亚组，分别对两个亚组进行了预后分析（表2和表3）。结果显示：对HCC-C患者而言，OS预后的危险因素为年龄>50岁、多个肿瘤结节、宏观血管侵犯和肿瘤最大直径> 5 cm，抗乙肝病毒治疗是其保护因素；对HCC-NC患者而言，OS预后的危险因素为男性、ALT > 80 IU/L、AFP > 400 ng/ml、多个肿瘤结节、宏观血管侵犯、肿瘤低分化和肿瘤最大直径> 5 cm(表2)。肝癌患者复发的危险因素为多个肿瘤结节、宏观血管侵犯、AFP > 400 ng/ml、肝硬化和肿瘤最大直径> 5 cm。其中多个肿瘤结节、宏观血管侵犯、AFP > 400 ng/ml、肝硬化和肿瘤最大直径> 5 cm也是HCC-C和HCC-NC患者的DFS预后的危险因素，但肿瘤低分化仅与HCC-NC患者的DFS相关。上述分析结果被Kaplan–Meier生存分析法进一步证实(补充图2-6)。
2.4 疾病标记物（HIF-1α、HBx、HBx双突变）同HCC-C和HCC-NC患者预后的关系
我们还分析了三个生物标记物（HIF-1α、HBx、HBx双突变）同HCC-C和HCC-NC患者预后的关系。我们之前的研究结果显示HIF-1α同肝癌患者OS和DFS呈负相关[22]。我们更新随访时间至2014年6月发现HIF-1α仍同肝癌患者OS和DFS呈负相关（图2A和2B）。我们将患者分为HCC-C和HCC-NC两个亚组进行分析时发现HIF-1α同HCC-NC患者的OS呈负相关，但与HCC-C的OS无关（图2C和2E）。HIF-1α同HCC-NC患者DFS无关，但在HCC-C患者中，HIF-1α高表达的患者有DFS预后较差的趋势，尽管尚不具有统计学意义(P=0.103，图2D)。
在被检测的100例肝癌标本中，68例（68%）呈HBx阳性表达。HBx表达主要位于细胞胞浆。HBx表达和患者OS无关（图3A），但与患者DFS呈负相关（图3B）。HBx阴性表达的患者平均DFS为75.5±11.3个月，HBx阳性表达的患者平均DFS为41.5±7.0个月（P=0.019，图3）。进行亚组分析结果显示：HBx的表达仅和HCC-NC患者的DFS相关。HBx阳性的HCC-NC患者的平均DFS为50.4±13.4个月，HBx阴性的HCC-NC患者的平均DFS为97.0±14.1个月（图3F）。
我们之前的研究结果显示101例肝癌患者的乙型肝炎病毒C基因启动子（BCP）中有53.47%的患者有1762位点突变，50.50%的患者有1764位点突变，35.6%的患者同时有1762和1764位点突变。生存分析显示HBx 1762T/1764A双突变和肝癌患者OS无关，但和肝癌患者DFS有关。有HBx 1762T/1764A双突变的肝癌患者的平均DFS为51.5±11.0个月，没有HBx 1762T/1764A双突变的肝癌患者的平均DFS为79.5±8.6个月（图4B）。亚组分析显示：HBx 1762T/1764A双突变和HCC-NC患者OS相关，没有双突变的患者的平均OS为119.9±11.1个月，有双突变的患者的平均OS为83.6±14.4个月（P=0.049，图4E）。HBx 1762T/1764A双突变在两个亚组中均有DFS预后较差的趋势，虽然尚不具有统计学意义（P=0.137和0.114，图4D和4F）。
3 讨论
本研究分析了HCC-NC和HCC-C患者临床特征和预后的差别。HCC-NC患者和HCC-C患者在年龄、性别、AFP水平、组织分化程度和宏观血管侵犯上均无明显差异。但HCC-C患者通常所患肿瘤结节为多个，瘤体较小，这和之前的文献报道相一致[28-32]。两个亚组的患者在术后第1年的存活率和复发率上无明显差异，但是HCC-NC患者远期预后较HCC-C患者好。Kaplan–Meier生存分析和多因素回归分析示肝硬化是影响HBV相关的肝癌患者根治术后OS和DFS的独立危险因子。
据报道，大多数肝癌是通过“stepwise”的方式逐步形成的，即从不典型增生结节发展为癌；而起源于非肝硬化组织的肝癌则是通过“de-novo”的方式形成的，即从正常肝组织或肝炎组织发展为肝癌[8,33]。同时还有研究显示p53、Rb、β-catenin等癌基因和抑癌基因的突变在两个亚组中存在较大差异[8,,10]。这些研究结果均提示HCC-C和HCC-NC在预后特征上可能有所不同。多因素Cox回归分析显示多个肿瘤结节、宏观血管侵犯、AFP > 400 ng/ml、肝硬化和肿瘤最大直径> 5 cm是影响肝癌患者OS和DFS的独立危险因素。亚组分析显示多个肿瘤结节、宏观血管侵犯和肿瘤最大直径> 5 cm是两个亚组共同的预后相关因素。但男性、ALT > 80 IU/L、AFP > 400 ng/ml和低分化程度只和HCC-NC患者的OS相关，和HCC-C患者的OS无关。同时年龄> 50岁只是HCC-C患者OS预后相关因素却不是HCC-NC患者OS的预后相关因素（图5）。此外虽两个亚组的患者均能从抗病毒治疗中获益，但HCC-C组的患者更为明显。
目前很多生物标记物被报道能够用于肝癌预后的判断，但是较少研究根据是否合并肝硬化而进行了亚组分析[18-20]。本研究分析了三个生物标记物：HIF-1α，HBx和HBx 1762T/1764A双突变。我们的前期研究显示HIF-1α和肝癌患者OS及DFS呈负相关[22]。本研究发现HIF-1α仅和HCC-NC患者OS相关，但和HCC-C患者OS无关。HIF-1α和HCC-NC患者的DFS无关，但在HCC-C患者却有与DFS呈负相关的趋势，尽管尚不具有统计学差异。与HIF-1α相似，HBx和HBx 1762T/1764A双突变在两个亚组中的预测价值也不相同。
不同文献报道的HCC-NC患者在整个HCC患者中所占的比例有所不同（7%-54%）[4-6]。根据我们所得的实验结果，理论上进行推导，HCC-C患者所占的比例越高，HIF-1α，HBx和HBx 1762T/1764A双突变同患者OS有关联的可能性就越小。这也可能是诸多报道存在不同结果的原因之一。
本研究也存在着一些不足。因为肝癌患者的预后受多种因素影响，所以我们制定了较为严格的入选标准，以便准确地评价肝硬化对肝癌患者预后的影响。只有接受了肝癌根治性切除术、肝功能Child-Pugh A级、乙肝表面抗原阳性、丙肝核心抗体阴性的患者才能入选，所以最终入选的肝癌病例339例。当进行亚组分析时样本量就相对较小了。而分析HIF-1α，HBx和HBx 1762T/1764A双突变同肝癌患者预后的关系时样本量则更小，大大降低了统计效能。
抗病毒治疗是改善肝癌根治性切除术后患者预后的重要途径之一。尽管其能否有效抑制肝癌复发尚未形成一致意见，但是不断增加的数据表明抗病毒治疗能够延长患者总的生存时间。这可能得益于抗病毒治疗能减少围手术期的病毒再激活，进而减少术后肝衰竭的发生率。同时抗病毒治疗还能延缓肝病的发展，保护残存的肝脏，为复发时再次手术治疗创造机会。结合我们之前的研究结果[27]，我们建议肝癌患者尤其是合并有肝硬化的肝癌患者应该接受抗病毒治疗。
总之，本研究显示HCC-C和HCC-NC患者在组织病理、临床特征、预后和抗病毒治疗获益方面均存在差异。因此临床上若将HCC患者进行亚组分析可能更为合理，有可能减少肝癌预后分析过程中产生的争议和更好的管理这种恶性疾病。
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