重症急性胰腺炎（severe acute pancreastitis ，SAP ）是临床常见的急腹症，病情凶险，病死率高，易伴发全身炎症反应综合征（SIRS ），甚至多器官功能不全综合征（MODS ）。氧调节蛋白150 （ORP150 ）是葡萄糖调节蛋白（GRPs ）家族的成员。它作为一种应激蛋白，正常情况下表达很低。当细胞和组织暴露于缺氧、缺血. 再灌注损伤等应激环境时则能诱发内质网应激，从而使ORP150 的表达增高。本研究观察急性坏死性胰腺炎（ANP ）大鼠胰腺组织中ORP150 基因的表达，探讨其在ANP 大鼠胰腺损伤中的作用。
一、材料与方法
1. 实验动物及分组：6 ～7 周龄SPF 级雄性Wistar 大鼠54 只，购自湖北省疾病控制中心，体重200 ～ 240 g。按完全随机法将大鼠分为假手术1 、3 、6 、12 h 组，ANP 1 、3 、6 、12 h 组和塞来昔布治疗1 h 组，每个时间点6 只大鼠。假手术组大鼠在开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹。ANP 组经胰胆管逆行注射5% 牛磺胆酸钠1ml/kg 体重（Sigma 公司）制模。治疗组于造模前30 min 经股静脉注射塞来昔布10 mg/kg 体重。所有大鼠术后均皮下注射生理盐水20ml/kg 体重补液。按各时间点处死大鼠，心脏采血，离心分离血清，保存于-20℃ 备用，取胰头组织4% 多聚甲醛固定，其余胰腺组织经液氮固定后冻存于-80℃ 。
2. 血清淀粉酶检测：血清淀粉酶采用全自动生化分析仪测定。
3. 胰腺组织病理学检查：取多聚甲醛固定的胰头组织，常规脱水、包埋、切片、HE 染色。由2 位病理科医师采用双盲法子光镜下观察胰腺组织的病理学改变，并参照Schmidt 等…标准进行评分。
4. 胰腺组织ORP150 mRNA 表达检测：ORP150 （495 bp ）引物序列：上游5'-TCTCCTACCACCTCTATTT-3' ，下游5'-CAGCACCCTTCCTACA-3' ；Actin （207bp ）引物序列：上游5'-CCAACTGGGACGATATGGAG-3' ，下游5'-CAGAGGCATACA-GCGACAAC-3' ，引物由Invitrogen 公司合成。采用RT-PCR 检测ORP150 mRNA 表达。取约100 mg 胰腺组织，应用Trizol （Invitrogen 公司）抽提组织总RNA 。应用cDNA 逆转录试剂盒（TOYOBA 公司）逆转录成cDNA 。应用PCR 试剂盒（MBIFermentas 公司）行PCR 反应。反应条件：94℃ 5min ，94℃30 s 、54C （ORP150 ）或56℃ （Actin ）30 s 、72℃1min，35 个循环，72℃7min 。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、扫描，以ORP150 与Actin 条带的灰度比值表示ORP150 mRNA 的表达水平。
5. 胰腺组织ORP150 蛋白表达的检测：取-80℃ 保存的胰腺组织50 mg ，用冰预冷的0.01 mol/L PBS 充分洗涤后，加入适量RIPA 蛋白提取液裂解40 min ，4℃ 离心取上清，常规行蛋白质印迹法检测ORP150 蛋白的表达。兔抗大鼠ORP150—— 抗（Santa Cruz 公司）工作浓度1 ：3000 ，HRP- 山羊抗兔IgG （Pierce 公司）工作浓度1 ：1000 。最后ECL （SantaCruz 公司）发光，X 线底片曝光、显影。以ORP150 条带与内参条带的灰度比值表示ORP150 蛋白表达水平。
6. 统计学分析：各组数据以x±s 表示，组间差异采用单因素方差分析，应用SPSS 16.0 统计软件分析。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。
二、结果
1. 血清淀粉酶变化：假手术1 、3 、6 、12 h 组，ANP 1 、3 、6 、12 h 组和塞来昔布治疗1h 组大鼠的血清淀粉酶活性分别为（930±117 ）、（945±110 ）、（1047±176 ）、（1061±148 ）、（2649±374 ）、（3562±286 ）、（4166±402 ）、（5549±637 ）、（1523±65 ）U/L ，ANP 组较假手术组明显升高，且随时间延长而逐渐升高，治疗组较ANP 1 h 组显著降低，但仍显著高于假手术组，差异均具有统计学意义（P 值均＜0.05 ）。2. 胰腺组织病理变化：假手术组大鼠的胰腺组织未见明显病理改变；ANP 组大鼠胰腺可见不同程度的水肿、出血及片状坏死，腺叶间隙增宽，炎性细胞浸润等，且随病程延长逐渐加重；治疗1h 组大鼠胰腺的损伤较ANP 1 h 组有所减轻（图1 ）。假手术1 、3 、6 、12 h 组，ANP 1 、3 、6 、12 h 组和塞来昔布治疗1 h 组大鼠的胰腺病理评分分别为（0.18±0.02 ）、（0.22±0.02 ）、（0.26±0.41 ）、（0.35±0.27 ）、（5.15±0.56 ）、（7.69±0.63 ）、（9.81±0.57 ）、（11.30±1.70 ）、（3.23±0.31 ）分，ANP 组较假手术组明显升高，且随时间延长而逐渐升高，治疗组较ANP 1 h 组显著降低，但仍显著高于假手术组，差异均具有统计学意义（P 值均＜0.05 ）。
3. 胰腺组织ORP150 mRNA 及蛋白表达的变化：假手术1 h 组，ANP 1 、3 、6 、12 h 组和塞来昔布治疗1 h组大鼠胰腺组织ORP150 mRNA 表达量分别为0.058 、0.589 、0.097 、0.093 、0.044 和1.338 ； ORP150蛋白表达量分别为0.040 、1.645 、1.605 、0.490 、0.174 和2.250 （图2 、3 ）。ANP 1 h 组的ORP150 mRNA 及蛋白表达最高，随着时间延长表达逐渐降低，除12 h 点mRNA 表达量外，其他各组均显著高于假手术组，塞来昔布治疗1h 组的表达量又较ANP 1 h 组显著升高，各组间差异具有统计学意义（P 值均＜0.05 ）。
图 1 假手术1h 组（a ），ANP 1 、3 、6 、12h 组（b-e ）和塞来昔布治疗1h 阻（f ）大鼠的胰腺病理变化（HE×200 ）
图 2 各组胰腺组织ORP150mRNA 的表达
图 3 各组胰腺组织ORP150 蛋白表达
讨论 氧化应激是机体内活性氧（ROS ）和活性氮（RNS ）大量生成及抗氧化物质失衡状态下，直接或间接通过信号转导通路引起的细胞损伤。很多危重疾病，如脓毒血症、烧伤、急性呼吸窘迫综合征（ARDS ）、艾滋病（AIDS ）等都会出现ROS 、RNS 的增加和抗氧化能力下降。氧化应激在急性胰腺炎（AP ）胰腺损伤、局部或全身并发症中亦起着至关重要的作用。氧自由基直接参与了AP 相关的MODS 中的细胞损伤和细胞内信号途径的调节，同时亦参与了AP 时白细胞的激活、NF-κB 活化引起的炎性细胞因子的表达、微循环障碍等过程。
ORP150 是一类存在于内质网的蛋白质，广泛分布于肝脏、脑、胰腺、肺等组织。它与其他葡萄糖调节蛋白一起应对各种应激环境。当机体处于应激环境时，ORP150 高表达，与受损或者新合成的蛋白质短暂性地结合，防止其形成二聚体和蛋白质构象的错误折叠。ORP150 作为内质网的分子伴侣，在很多疾病的发病过程中均发挥着保护作用。有研究报道，ORP150 能抑制缺氧导致的细胞凋亡，对缺氧情况下的脑组织和心肌细胞的凋亡有保护作用。抑制ORP150 在脑星形细胞的表达会加快细胞的缺氧死亡，而刺激体外培养的神经元ORP150 表达则能阻止脑细胞的缺氧性死亡。此外，ORP150 的表达能加快皮肤伤口愈合，改善大鼠缺血性骨坏死。
本研究结果显示，ANP 大鼠胰腺组织ORP150 基因表达在制模后1h 即迅速升高，然后逐渐下降，推测ORP150 可能通过内质网应激参与了ANP 的发病过程。但ORP150 在ANP 大鼠胰腺损伤中发挥作用的具体机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。
国外有体外实验证实塞来昔布能够上调组织中的ORP150 表达水平。因此，本研究选用塞来昔布作为干预手段来观察ANP 大鼠胰腺组织ORP150 表达水平的变化。结果显示，在制模前1h 给予塞来昔布干预，胰腺组织中的ORP150 mRNA 和蛋白的表达水平较ANP 1h 组确实升高，胰腺组织病理损伤减轻，胰腺病理学评分及血清淀粉酶水平均降低，提示ORP150 表达水平的提高在ANP 的胰腺损伤中发挥了保护作用。
